什么是數(shù)字PCR？

　　提起PCR，在生物及其相關(guān)行業(yè)內(nèi)，半個(gè)世紀(jì)以來分子診斷的高速發(fā)展離不開分子生物學(xué)技術(shù)特別是PCR技術(shù)日新月異的進(jìn)步。1983年由美國Mullis首先提出設(shè)想，1985年發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)，即簡易DNA擴(kuò)增法，標(biāo)志著PCR技術(shù)的真正誕生。1999年，美國學(xué)者KennethKinzler與BertVogelstein提出了數(shù)字PCR(digitalPCR，dPCR)的概念，實(shí)現(xiàn)了核酸拷貝數(shù)定量的突破，成為一種全新的核酸檢測方法，與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，具有高靈敏度、高度、高耐受性和定量的優(yōu)點(diǎn)。那么這項(xiàng)技術(shù)究竟有何神通之處？有哪些廣闊的應(yīng)用前景呢？

　　一、基礎(chǔ)研究篇

　　1.基因表達(dá)差異研究

　　數(shù)字PCR由于檢測時(shí)*不依賴傳統(tǒng)的Ct值即可實(shí)現(xiàn)真正意義上的定量，因而可以提供比實(shí)時(shí)熒光定量PCR更精確的基因差異表達(dá)研究，尤其對于那些靶基因表達(dá)差異微小的情況，如：mRNA、microRNA、lncRNAs等的表達(dá)分析；等位基因的不平衡表達(dá)；單細(xì)胞基因表達(dá)分析；外泌體核酸分子定量分析等。

　　2.拷貝數(shù)變異（CNV）研究

　　微滴化的樣品處理及檢測，這種擺脫Ct值的計(jì)算方法而直接獲取目標(biāo)基因的拷貝數(shù)，為拷貝數(shù)變異的研究提供了的檢測精度。是其他諸如二代測序、芯片雜交等平臺(tái)無法達(dá)到的。采用數(shù)字PCR能夠有效對二代測序（NGS）和微陣列比較基因組雜交（aCGH）等實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并具有檢測周期短、成本低、樣本通量高等特點(diǎn)。

　　3.低豐度DNA模板分子的精確定量

　　由于絕大部分微液滴中只含單個(gè)或不含模板分子，使得低豐度DNA模板分子的擴(kuò)增不受高豐度模板分子擴(kuò)增的競爭抑制：與此同時(shí)，樣品中可能存在的抑制劑也在分配到微液滴的過程中進(jìn)行了相對稀釋，作用于單個(gè)微液滴內(nèi)模板擴(kuò)增的抑制劑數(shù)量大幅降低，從而提高PCR擴(kuò)增對抑制劑的耐受程度，因此可應(yīng)用于諸多臨床樣品（如血液、尿液、糞便、痰液、胸腹水、腦脊液等）中痕量核酸標(biāo)記物的檢測。一般而言，毛細(xì)管電泳和定量PCR的檢測靈敏度約在10%，NGS的靈敏度可達(dá)到1%，而數(shù)字PCR的檢測下限可輕松實(shí)現(xiàn)0.001%。

　　4.甲基化含量鑒定

　　作為表觀遺傳學(xué)研究中重要的一個(gè)研究方向——甲基化程度分析，現(xiàn)階段有不同的方法或技術(shù)來進(jìn)行研究：如傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽處理后的克隆測序法、抗體檢測法、定量PCR檢測法等受限于方法學(xué)的問題，不能獲得甲基化程度的精確定量，而數(shù)字PCR系統(tǒng)通過對樣品的微液滴處理及目標(biāo)分子的拷貝數(shù)定量，為甲基化程度的精確定量檢測提供了一種可靠的技術(shù)。

　　5.二代測序輔助建庫

　　目前靶向測序建庫方法包括擴(kuò)增子方法，在均相溶液中，當(dāng)擴(kuò)增引物增加時(shí)，由于擴(kuò)增引物之間的相互作用，從而影響擴(kuò)增的效率；如果將其分散到大量微液滴中擴(kuò)增，將可大大降低引物間相互作用，提高擴(kuò)增效率。同時(shí)還可以實(shí)現(xiàn)對于少量模板的有效擴(kuò)增，得到更多的有效測序數(shù)據(jù)。

　　6.CRISPR-Cas9基因編輯結(jié)果驗(yàn)證

　　CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)明，是基因編輯技術(shù)的一大突破，但如何驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)是否成功，仍需要高靈敏度的檢測方法，數(shù)字PCR技術(shù)可以滿足這一需求。Broad研究所張鋒團(tuán)隊(duì)發(fā)明了以CRISPR為基礎(chǔ)的SHERLOCK技術(shù)可以對核酸進(jìn)行高靈敏度的定性檢測，但精確定量評估時(shí)仍采取了數(shù)字PCR進(jìn)行確認(rèn)。

　　二、疾病研究篇

　　7.腫瘤的液體活檢

　　腫瘤學(xué)研究是數(shù)字PCR的重要應(yīng)用領(lǐng)域，該技術(shù)作為極為重要的工具，能夠識(shí)別DNA突變（例如EGFR）、腫瘤患者用藥監(jiān)控、基因擴(kuò)增檢測、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）特性研究、長鏈非編碼RNA檢測、液體活檢中循環(huán)的核酸（cfDNA）和腫瘤細(xì)胞（CTC）的定量等研究中。

　　癌癥標(biāo)志物稀有突變檢測

　　在一份給定的樣本中，相比于野生型DNA，癌癥相關(guān)的突變序列比例較低，經(jīng)常無法檢測。而憑借其超高靈敏度，dPCR系統(tǒng)可以很容易地定量分析低至0.001%-0.0001%的突變頻率。之前用任何方法都無法實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確穩(wěn)定檢測的樣本，現(xiàn)在可以使用dPCR輕松進(jìn)行定量分析。例如，已實(shí)現(xiàn)肺癌相關(guān)的表皮生長因子受體（EGFR）中T790M突變的檢測，可以更好地評估抗酪氨酸激酶抑制劑的治療。

　　腫瘤治療的伴隨診斷

　　常用體液來源（如血液，胸腹水，唾液及尿液等）的待檢標(biāo)本中的DNA，有正常脫落體細(xì)胞和病變脫落細(xì)胞兩種來源，前者的量遠(yuǎn)大于后者。通過微液滴處理能在每個(gè)微液滴中有效減少正常體細(xì)胞DNA的干擾，實(shí)現(xiàn)腫瘤標(biāo)記物的有效檢測，如EGFR，ALK，ROS1，KRAS、BRAF等基因的突變檢測、乳腺癌/胃癌的HER2基因擴(kuò)增檢測等，應(yīng)用于腫瘤醫(yī)學(xué)的伴隨診斷。

　　腫瘤治療的實(shí)時(shí)監(jiān)控

　　已有數(shù)篇文章報(bào)道了使用數(shù)字PCR技術(shù)對患者治療過程中的循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）進(jìn)行檢測，實(shí)時(shí)監(jiān)控疾病進(jìn)展。在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌和腸癌等多種腫瘤患者中都取得了令人鼓舞的結(jié)果。與影像學(xué)及其他常規(guī)指標(biāo)相比，ctDNA突變及豐度改變通常會(huì)提前數(shù)月出現(xiàn)，這樣就可以提醒醫(yī)生及時(shí)調(diào)整治療方案，使患者得到更有效的治療。

　　8.糖尿病

　　數(shù)字PCR技術(shù)目前在糖尿病中的研究熱點(diǎn)，通過定量檢測非甲基化DNA的水平，對I型糖尿病β細(xì)胞死亡進(jìn)行定量，從而監(jiān)控病情發(fā)展。

　　9.無創(chuàng)產(chǎn)前篩查

　　無創(chuàng)傷的產(chǎn)前診斷,如21號染色體為3倍體的唐氏綜合征、已知父母基因型的胎兒地中海貧血或胎兒遺傳性耳聾基因檢測等。目前無創(chuàng)檢測標(biāo)本來源主要為孕婦血液，而待檢測的胎兒DNA受到母體DNA的干擾，影響了檢測的準(zhǔn)確性。數(shù)字PCR技術(shù)可以作為二代測序法的補(bǔ)充來進(jìn)行無創(chuàng)傷產(chǎn)前診斷，從而提高工作效率、降低檢測成本。

　　10.致病微生物（病毒、細(xì)菌等）的檢測

　　疾病預(yù)防控制中心、出入境檢驗(yàn)檢疫局系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室可以將基于TaqMan探針法的定量PCR體系無縫地轉(zhuǎn)移到數(shù)字PCR上，從而滿足該類實(shí)驗(yàn)室對于檢測結(jié)果的要求：靈敏度更高、重復(fù)性更好、無需依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量結(jié)果，同時(shí)操作簡便。

　　11.肥胖

　　數(shù)字PCR技術(shù)能夠檢測到引起肥胖的重要因素之一AMY1（唾液淀粉酶）的基因拷貝數(shù)。

　　12.傳染性疾病

　　數(shù)字PCR技術(shù)因起高精密度、耐受能力強(qiáng)、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，逐漸被用于病毒載量分析的相關(guān)研究。如HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療過程中病毒殘留量的監(jiān)控；HBV耐藥突變的檢測；HCV的分子分型；抗甲氧西林金黃色葡萄球菌的院內(nèi)感染監(jiān)控；環(huán)境微生物不同功能基因之間的連鎖分析等等。

　　13.移植排斥監(jiān)控中的應(yīng)用

　　為了降低移植中移植物排斥導(dǎo)致的風(fēng)險(xiǎn)，數(shù)字PCR技術(shù)通過監(jiān)測受體中移植器官供體的循環(huán)DNA水平來檢測早期移植排斥。

　　14.腸道菌群分析：數(shù)字PCR技術(shù)直接計(jì)算目的序列的拷貝數(shù)，對樣品中的微生物實(shí)現(xiàn)了定量，可用于微生物檢測，以便進(jìn)一步研究腸道菌群的結(jié)構(gòu)、功能以及數(shù)量。

　　三、其他領(lǐng)域篇

　　15.轉(zhuǎn)基因食品或成分的檢測：目前在確定轉(zhuǎn)基因作物或成分的含量時(shí)采取定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線法，這種方法需要依賴于已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(CertifiedReferenceMaterialsCalibrants,CRMCs)。ddPCR定量的方式可以*解決這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定標(biāo)工作，從而確保安全和品質(zhì)。

　　16.環(huán)境監(jiān)測：基因目標(biāo)的環(huán)境監(jiān)測，需要對復(fù)雜樣品中低濃度的目標(biāo)進(jìn)行準(zhǔn)確檢測。ddPCR每次運(yùn)行中能創(chuàng)建數(shù)千個(gè)PCR反應(yīng)室，帶來了目標(biāo)的準(zhǔn)確測定，即使它們濃度很低，因此可以實(shí)現(xiàn)對土壤、污水、淤泥、酒泥等為樣本的環(huán)境生物學(xué)研究和病原微生物監(jiān)測。

　　17.基因型鑒定：PCR也可以用于檢測一個(gè)生物中是否存在某特定DNA序列，這被稱為基因型鑒定。例如，基因型鑒定可通過發(fā)現(xiàn)樣品中是否存在某種群特異性序列來判斷樣本的真實(shí)性?；蛐丸b定還可用于法醫(yī)分析判斷在現(xiàn)場發(fā)現(xiàn)的DNA樣品是否和人的吻合，令兇手無處遁形。

　　18.早期檢驗(yàn)疫情：2016年，例數(shù)字PCR動(dòng)物疫病檢測試劑研發(fā)成功，包括H7N9、藍(lán)耳病、高致病性美州株、豬的流行性腹瀉等動(dòng)物疫病檢測試劑盒。此項(xiàng)技術(shù)的推出，將有助于在食品安全的源頭及早發(fā)現(xiàn)疫情，盡早處理避免更大面積的傳染，更好地控制漏檢，減少傳染人的幾率；也將有助于國家建立規(guī)范化、規(guī)?；膭?dòng)物疫病新型檢測方法。

　　19.藥物基因組檢測：能夠通過PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)藥物基因組的檢測，提高合理用藥水平，具有通量較高，操作簡單，儀器設(shè)備易普及等優(yōu)點(diǎn)。